2020-05-27
前言：單堿基基因編輯技術，自2016年4月被報道以來，因其不引入DNA雙鏈斷裂，且編輯更加高效、安全而備受關注，近幾年來逐漸成為地中海貧血、血友病等遺傳疾病基因治療的熱門工具之一。然而，現有的堿基編輯器只能催化單一類型堿基C或A，這在較長時間和很大范圍內限制了其廣泛應用。因此，開發一種簡單且高效的堿基編輯器實現兩種不同類型堿基轉換，即同時實現C>T和A>G，一直是堿基編輯器優化探索的重點和難點。
2020年6月1日，上海邦耀生物科技有限公司（下稱邦耀生物）與華東師范大學劉明耀教授及李大力教授團隊合作，在國際著名學術期刊Nature Biotechnology雜志發表了題為“Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells”的研究論文。這也是邦耀生物在2020年，繼發表在Nature Medicine、Nature Cell Biology、Cell Research等期刊的基因治療成果后，在單堿基編輯工具開發領域的又一重大突破，為基礎研究和遺傳性疾病如β-地中海貧血的治療提供了新的發展方向和工具。華東師范大學張曉輝，朱碧云和陳亮為本文共同第一作者，華東師大生命科學學院李大力教授為通訊作者。
該研究將胞嘧啶脫氨酶hAID-腺嘌呤脫氨酶-Cas9n（SpCas9 D10A突變體）融合在一起，開發出了一種新型雙功能堿基編輯器-命名為：A&C-BEmax，它不僅可以實現單獨的C>T或A>G，還可以在同一等位基因上同時實現C>T和A>G的高效轉換。與已報道單堿基編輯器（ABE或CBE）相比，A&C-BEmax可使C>T的編輯窗口被拓寬，效率得以提升；A>G的窗口保持不變，效率略微下降；RNA脫靶水平大大降低。
獨辟蹊徑，同時實現兩種堿基高效轉換
由于CBE和ABE只能催化單一堿基的轉換，研究團隊猜測如果重新組合胞嘧啶和腺嘌呤工具，是否能實現兩種堿基簡單而高效的轉換呢？因此，通過將胞嘧啶脫氨酶hAID和腺嘌呤脫氨酶在Cas9n兩端進行位置的不同組合融合成了五種構建體，通過哺乳動物細胞測試，發現將胞嘧啶脫氨酶融合到ABE7.10的N端展現出A/C同時轉換的特性，但此時效率偏低。
不斷優化方案，實現更高編輯效率
為了克服效率偏低的難題，研究團隊不斷嘗試和調整技術方案，最終發現通過優化ABE7.10-N-AID中的Cas9n密碼子，融合雙分型核定位信號（bpNLS），優化linker序列和融合兩個拷貝的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑（UGI），獲得了一種高效的A/C同時轉換的編輯器，將其命名為：A＆C-BEmax（圖1）。
圖1：A&C-BEmax模式圖及不同構建體
A＆C-BEmax：一種非常特異的雙功能堿基編輯器
與原始構建體相比，A＆C-BEmax的堿基轉化效率，產物純度和A/C同時轉換活性顯著提高，C>T的編輯窗口大幅增加，且更安全，RNA脫靶率更低。為了更加廣泛的評價A＆C-BEmax的性能，科研人員在HEK293T細胞中測試了28個內源性靶點（其中4個靶點僅包含Cs或As），同時與ABEmax和AID-BE4max進行對比。
測試顯示，在同一靶點，A＆C-BEmax的C>T編輯窗口從C3-C10位擴展到了C2-C17位，在C7-C17位的編輯活性相對于AID-BE4max提高了1.9-14倍（圖2），而A>G的編輯效率與ABEmax相似或略有降低，但比ABEmax在RNA上的脫靶率更低，同一等位基因的A和C同時突變效率最高達到30％。同時，數據表明，與CBE和ABE相比，A＆C-BEmax編輯效率、產物純度、堿基突變的飽和度及突變類型和A/C同時轉換活性顯著提高，幾乎不產生DNA脫靶以及RNA水平的脫靶也大大降低。由此可見，A＆C-BEmax是一種具有高特異性且安全的雙功能堿基編輯器。
圖2：A＆C-BEmax的工作特性
新型編輯器在地貧治療，表現巨大潛力
為了進一步驗證A＆C-BEmax在基因治療中的應用，將A＆C-BEmax遞送到類紅細胞前體細胞中(HUDEP-2)，結果表明，A＆C-BEmax能有效地聯合破壞BCL11A轉錄抑制因子結合位點（-114C>T或-115C>T），并同時創建轉錄激活因子GATA1的結合位點（-113A>G），這是現有ABE或CBE都無法做到的，與周圍單獨產生C的編輯細胞相比，A/C同時突變后分化的HUDEP-2細胞具有更高的HBG表達水平（圖3）。該工作展示了A&C-BEmax新型堿基編輯系統對于在高效治療β-血紅蛋白病的巨大潛力，為徹底治愈重癥β地貧提供了新的方法。
圖3：A＆C-BEmax在HUDEP-2細胞中高效激活HBG表達
最后，研究團隊通過計算機在Clin Var和dbSNP(SNPs)臨床數據庫中分析了所有A＆C-BEmax可靶通過聯合C>T和A>G靶向糾正203個臨床報道的致病突變；進一步拓展PAM為NG時，靶向范圍增加了2.8倍（?573）。這表明A＆C-BEmax在聯合C>T和A>G糾正引起人類致病突變方面擁有巨大的臨床應用潛力。
邦耀生物深耕基因治療領域，突破不斷
邦耀生物自成立以來，一直聚焦于基因編輯和基因治療領域，自主研發并搭建起基因治療技術轉化平臺，并且在基因編輯和基因治療領域已經遞交30余項全球及中國專利申請。回首邦耀生物的開拓之路,是一段不斷突破與創新的過程，特別是去年以來，邦耀科學家團隊在基因編輯工具開發和基因治療地中海貧血領域，已經持續取得很多突破性進展：
2019年3月，邦耀生物科學家吳宇軒博士，在Nature Medicine發文，發現利用基因編輯技術靶向編輯BCL11A紅系增強子，會重新開啟γ珠蛋白表達，代替有缺陷的β珠蛋白，有望達到根治此類疾病的目的；
2020年1月，劉明耀教授和李大力教授團隊，率先證明單堿基編輯器編輯技術靶向HBG啟動子激活胎兒期血紅蛋白的表達，對于治療β地中海貧血的可行性與有效性，相關研究發表在國際著名學術期刊Cell Research；
2020年3月，邦耀生物科學家吳宇軒博士，在國際著名學術期刊Nature Medicine發文，證明單堿基編輯技術可以靶向BCL11A的紅系增強子原件激活胎兒期血紅蛋白，或者編輯β血紅蛋白基因的特定突變，有望通過編輯自體造血干細胞治療包括β地貧在內的β血紅蛋白病；
2020年5月，最新發表在Nature Cell Biology的文章又報道了李大力教授團隊最新自主研發的hyCBEs系列工具擁有更高的編輯活性和更寬的編輯窗口，對于β血紅蛋白病的治療具有更大的優勢；
本次突破研究，更是打破現有堿基編輯器限制，開發源頭創新的新型雙功能堿基編輯器，打造國內自主知識產權的基因編輯工具的重大研究成果，為基礎研究和遺傳性疾病如β地中海貧血的治療提供了新的平臺。
邦耀生物聯合創始人、總裁席在喜先生透露：邦耀生物已搭建了創新、高效的基因編輯平臺，邦耀在2020年以來在單堿基編輯器及其在基因治療遺傳疾病中的一系列突破性進展，將會為基因治療再添利器，邦耀生物正著力圍繞這幾項自主知識產權技術開展臨床轉化。自成立以來，邦耀生物一直聚焦于基因藥物和細胞藥物的開發，目前已與國內多家醫療單位合作，在遺傳疾病及惡性腫瘤的研究中取得了階段性突破。我們期待未來為更多癌癥和遺傳疾病患者帶來福音。
附原文鏈接：Zhang, X., Zhu, B., Chen, L. et al. Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells. Nat Biotechnol (2020).
https://doi.org/10.1038/s41587-020-0527-y
